洋葱伯克氏菌群的多样性

洋葱伯克氏菌群（Burkholderia cepacia complex，简称Bcc）是一类广泛存在于水、土壤、植物根围和人体中的革兰氏阴性细菌。它至少由10种表型相似但基因型不同的基因型组成。Bcc 在农业上的应用十分广泛，不但用于植物病害防治和促进农作物生长，而且也可用于保护环境、降解土壤中的有毒物质。同时它也是一种高风险的人体条件致病菌，可以使囊性肺纤维化(Cystic fibrosis，简称CF)病人患“洋葱伯克氏菌综合症”致死。明确Bcc 基因型种类和生物学功能的相关性一直是国内外的研究热点。为此，笔者简要综述了Bcc 基因型的生物学功能和种类及其鉴定技术的研究进展，以供Bcc 的进一步研究及应用借鉴。
1 Bcc 基因型多样性
洋葱伯克氏菌群里的成员最初归为假单胞菌属（Pseudomonas），1992 年依据16s rRNA 序列、DNA-DNA 同源性、细胞脂肪酸组分以及表型特征，7个非荧光种从假单胞菌属中划出归入伯克氏菌属（Burkholderia），其中B. cepacia 被命名为典型种。后来研究者注意到来自不同生境的Bcc 分离物具有明显的遗传异质性，这使得对当前广泛使用的菌株鉴定技术产生怀疑，当前的鉴定技术存在敏感性不强或专化性较弱的缺点。基于该菌株的遗传多样性以及可靠的鉴定技术的缺乏，Vandamme 等[6]采用多相分类技术将来源于医院和其它生境的Bcc 分离物划分为5 个基因型。到目前为止已发现10个基因型（I~X），除基因型I还沿用以前的种名，其他分别被命名为不同的种（表1），但通称为洋葱伯克氏菌群。
Bcc 菌广泛存在于农业环境和人体中，其中CF病人体内发现的基因型大多数为基因型III和II ，存在于环境中的基因型主要是I、III、VII 和IX。目前研究发现，除了基因型X 外，其它9 种基因型均能够从自然环境和人体中分离到。由此可知，人体Bcc 致病菌株与环境中的菌株在基因型水平上是没有明显区别的。
2 Bcc 的功能多样性
2.1 植物促生菌
Bcc 促进植物生长的机制主要源于两方面：一是产生植物生长激素（如IAA 等）供植物利用，或有助于植物对营养物质的吸收。如产生一种专门结合铁的小分子蛋白－嗜铁素（siderophore），它可直接或间接促进植物生长。另一方面是通过对病原微生物的抑制作用，从而间接地促进植物生长。如萎蔫酸（Fusaric acid）是Pythium 菌侵染植物后引起植物受害的重要物质，Bcc 可以通过代谢分解萎蔫酸来减轻植物受害程度。
2.2 植物病害生防菌
Bcc 用于生物防治主要作为生物杀虫剂和生物杀菌剂。目前在美国已经注册的Bcc 生物杀虫剂有“Type Wisconsin”、“Blue Circle”、“Deny”，其中“BlueCircle”和“Deny”也可以用于杀线虫。另有报道认为Bcc 作为冰核细菌具有危害的一面，但也可以用于防治储粮害虫。
Bcc 作为生物杀菌剂用于防治多种病害。目前美国注册的Bcc 杀菌剂有Intercepty，中国注册的有“亚宝”，它们可以防治多种真菌病害。国外以防治腐霉病、立枯病等土传病害的报道居多，但也有一些对苹果灰霉病、梨青霉病和桃褐腐病等采后病害以及茎叶部病害的研究报道。
2.3 生物降解菌
Bcc 可以利用200 多种物质为唯一碳源，且能够以土壤和地下水污染的有毒且难降解的物质（邻苯二甲酸盐、除草剂和氯代烃类化合物等）为碳源并将其降解。利用这一特性，它不但可以降解除草剂、含氯有机物、邻苯二甲酸盐等难降解物质，还能净化污水。如Bcc 的一个菌株G4 可以通过由苯酚诱导的芳香族降解途径将地表水和地下水中分布最广的污染物之一—三氯乙烯降解。
3 Bcc 基因型研究现状
3.1 Bcc 基因型的鉴定方法
由于Bcc 菌群的基因型多样，因而对Bcc 所有菌进行正确的分类和鉴定是必要的。国内外许多的研究者在这方面做了大量的工作，通过对Bcc 细菌进行表型试验、全细胞蛋白电泳分析、AFLP 指纹图谱、全细胞脂肪酸分析以及PCR 鉴定技术等来对各菌株进行基因型的分类和鉴定，但还没有一个非常有效的方法能鉴定出所有的Bcc 基因型。
近年来，研究者开始将Bcc 的多个基因作为检测目标来对其鉴定。Ramette 等[12]对Bcc 的recA 基因和16s rRNA 基因进行双PCR 扩增来快速筛选Bcc 菌群，然后结合recA-RFLP和菌落杂交技术对基因型进行鉴定。Baldwin 等[19] 提出了一种多位点序列分析（Multilocus Sequence Typing）的方法，即对7 个基因（atpD、gltB、gyrB、recA、lepA、phaC、trpB）分别进行巢式PCR 扩增，然后对目的片段进行序列分析，从而确定各个菌株的基因型种类。这两种方法均可以很好的区分各基因型，且准确度很高，但由于工作量大，成本较高，而且也没有一套可供参照的标准体系，所得的结果仍需要recA-RFLP方法的辅助鉴定。


到目前为止，国内外主要以Bcc 的recA 基因为靶标对象，采用PCR特异性扩增技术、recA-RFLP和recA序列分析相结合的方法对Bcc 进行基因型的划分。研究发现，基因型I 的recA引物专化性低，PCR 反应时，能与基因型IX 发生交叉反应，需要其它分析方法（如recA-RFLP测定）相结合才能将其区分开；基因型III的recA 引物专化性高，但是反应灵敏度较低，往往不能鉴定出所有该基因型的菌株[20]。因此，进一步提高引物的专化性和灵敏度也是今后努力的研究方向。
3.2 中国的Bcc 基因型研究现状
Bcc 菌作为人体条件致病菌于20 世纪90 年代在英国、加拿大等CF 病人中传播并大流行，导致多人死亡。2005 年中国首次报道了解放军总医院收治一例肺部大面积感染洋葱伯克氏菌的病人，最终治疗无效死亡，被确诊为“洋葱伯克氏菌综合症”。吕火祥等的研究表明，Bcc 对氨基糖苷类中的庆大霉素等已产生较高的耐药性，该病菌的医院分离率在1997—2003年的7年间提高了近7倍。但在中国医学领域，主要是开展了Bcc 菌的常规表型鉴定及抗药性监测研究，对该菌的基因型鉴定方面的研究很少，在农业方面的应用及研究情况更少。罗远婵[23]对来自医院的34株Bcc致病菌进行了基因型的鉴定，结果表明在医院菌株中检测到基因型Ⅰ、Ⅱ、ⅢA、ⅢD 和Ⅴ，且基因型ⅢA 为优势类型，它是引起洋葱伯克氏综合症的主要基因型，同时也发现医院存在较高比率的基因型Ⅰ菌。笔者曾对少数水稻、玉米和大麦根围的Bcc 菌群进行了调查，研究表明在水稻和玉米根围存在丰富的Bcc 菌，基因型Ⅴ和ⅢB 分别是水稻和玉米根围的优势菌，而大麦根围的Bcc 菌群则较少。由此可见，全面了解中国自然环境和医院中的Bcc 基因型有待于进一步研究。
4 问题与展望
Bcc 是目前国际上研究正热、颇富争议性的一类细菌，国内外研究人员正在对各种来源的Bcc 分离物开展相关研究工作，从其致病机制、生态多样性、0基因型区分等一系列方面入手来充分认识该菌。尤其是在基因型的区分上，国内外研究者进行了大量研究报道，对其认识也是越来越深入，基因型的鉴定方法也越来越成熟，而且也找出了一些区分致病菌株与非致病菌株的基因，但对Bcc 的认识仍有待进一步深入。Bcc 菌株由于具有庞大的基因组和插入序列，很容易在各基因型间变异转化，也容易对抗生素产生抗药性，所以对它的研究和控制具有很大的挑战性。中国的Bcc 基因型研究刚刚起步，破解Bcc 的奥秘需要农业、医学、环保等领域的微生物研究人员的通力合作。