两个类ADP_葡萄糖转运蛋白基因的克隆和特征

植物淀粉是大多数植物(如稻麦、薯类等) 种子与块茎的主要组成部分,也是人类的主要食粮和重要的工业原料。植物淀粉主要是由两类葡聚糖组成:直链淀粉( amylase) 、支链淀粉(amylopectin) 。不管直链淀粉还是支链淀粉都是在质体中合成,由ADP - 葡萄糖焦磷酸化酶(ADPG pyrop hosp hory2lase ,A GPase) 、淀粉合成酶( starch synt hase , SS) 、淀粉分支酶( starch branching enzyme ,BE) 和淀粉脱支酶( starch debranching enzyme , DE) 协同合成 。A GPase 的作用是产生合成淀粉的直接底物ADP - 葡萄糖(ADP - gluco se) ,因此,A GPase 被认为是淀粉合成的限速酶。在禾谷类作物胚乳中,ADP - 葡萄糖是细胞质中合成的,它需要在核酸糖转运蛋白(nucleotide sugar t ranslocater ,NST) 的作用下,才能跨过质体膜进入到质体中,参与淀粉的合成 。在玉米bt1 (brit tle - 1) 突变体中,籽粒的淀粉含量只有野生型的20 % ,而细胞质中ADP - 葡萄糖的含量却比野生型高12 倍 。生物学信息分析和直接试验证据都表明,玉米bt1 位点编码一个位于造粉体膜上负责转运ADP - 葡萄糖的蛋白,该基因主要在胚乳中发挥作用。接着,在其他植物中也克隆到了该基因 。
玉米( Zea mays L . ) 在我国是一种重要的粮食作物,种植面积在各类作物中始终占第3 位。玉米淀粉除了作为粮食外还被广泛用于食品加工、制药、能源等多种工业领域。因此,研究玉米淀粉合成的过程既有理论意义也有实践上的意义。以下报道了另外2 个玉米新的类B T 基因的克隆和特征。
1 　材料和方法
1. 1 　材料
所用玉米材料为来自临漳的地方品种,种植于华南植物园试验田,叶片和根取自四叶期,胚乳材料为玉米吐丝后5 d ,10 d ,15 d ,20 d ,25 d ,30 d 的种子。样品采集后立即放入- 80 ℃冰箱。所用大肠杆菌菌株DH5α来自中国科学院华南植物园实验室。
1. 2 　总RNA 的提取与逆转录
样品在液氮中研磨后用Trizol 试剂(invit ron)提取,提取方法按说明书进行。经1 %的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA 的浓度、纯度和完整性。取3μg 的RNA 采用Promega 公司的M - Mlv 逆转录酶按照其说明书进行逆转录,用转录后的单链cDNA 为模板进行基因扩增。
1. 3 　数据库搜索与PCR 扩增目标片段
根据推定的水稻ADP - 葡萄糖转运蛋白B T基因(Os05g07900) 序列,在基因组研究所数据库( ht tp : ∥www. tigr . org ) 、植物基因组数据库(www. plantgdb. org) 和GenBank ( ht tp : ∥www.ncbi. nlm. nih. gov/ ) 获得相关同源序列。根据获得的序列设计引物,上游引物: 5′- CTGA GCCGA T2GGGCA GTAA GA - 3′, 下游引物: 5′- GCTA T2CA GGA TTTCA GGA TGTC - 3′。反应体系采用20μL ,反应程序为94 ℃2 min ;94 ℃30 s ,58 ℃30 s ,72 ℃1. 5 min ,36 个循环;72 ℃6 min 。PCR 相关试剂均购自大连宝生物工程有限公司。
1. 4 　目标片段的回收、克隆、测序
PCR 结束后,用1 %的琼脂糖凝胶电泳,采用百泰克公司试剂盒进行目标片段回收,回收产物与T载体连接,按照大连宝生物工程公司pMD18 - T 试剂盒操作说明书进行,然后转化大肠杆菌DH5α,筛选到阳性克隆后送上海英俊(invit ron) 生物技术有限公司测序。
1. 5 　基因的生物信息学分析
测序结果采用Blastx 在GenBank 数据库中分析,以确认所获得的序列是否目标基因序列。用DNAstar 软件分析基因序列来确定蛋白的氨基酸序列。叶绿体信号肽通过Chloro P 1. 1 软件在网络上分析( ht tp : ∥www. cbs. dt u. dk/ services/ Chlo2ro P) 。进化树分析在网络上进行,参数设置按默认值(ht tp : ∥www. ncbi. nlm. nih. gov) 。
1. 6 　半定量PCR 分析该基因在叶片、根、胚乳中表达模式
A ct i n 引物根据玉米ACT1 设计, 上游引物:5′- GGAACTGGTA TGGTCAA GGC - 3′,下游引物: 5′- A GTCTCA TGGA TACCCGCA G - 3′。RT - PCR反应体系采用20μL ,预试验显示可以很好的进行扩增。ZmB T2a 上游引物: 5′- GTA2CA TACCCACTGGAA TTG - 3′, 下游引物: 5′-ACTGAGTTCTAATGATCTGC - 3′。ZmBT2b 上游引物:5′- GTACATACCCACTGGAATTG - 3′,下游引物:5′- AACTGAGTTCTAATGACGCA - 3′。所有引物都跨内含子以排除基因组污染,选择合适的循环数目,以确定反应产物累积在线性阶段。本试验通过条件优化, ZmA ct i n 扩增选择28 个循环,反应程序: 94 ℃2 min ;94 ℃30 s ,58 ℃ 30 s ,72 ℃ 45 s28 个循环; 72 ℃ 6 min 。胚乳、叶和根扩增选择32个循环,反应程序:94 ℃2 min ;94 ℃30 s ,56 ℃30 s ,72 ℃40 s ,32 个循环; 72 ℃ 6 min 。反应结束后,用1 %琼脂糖进行凝胶电泳然后用凝胶成像系统对结果进行记录。
2 　结果与分析
2. 1 　生物信息学分析
用水稻BT 基因序列(Os05g07900) 通过Blstn 搜索基因组数据库(http : ∥www. tigr. org ) ,获得EST片段TC333524 ,TC320777。TC333524 含有一个完整的阅读框,表示该序列可能是一个全长cDNA 序列。用TC333524 , TC320777 序列搜索植物基因数据库(http : ∥www. plantgdb. org) 发现这2 个片段分别位于8 号染色体AC199046 ,6 号染色体AC216196 2 个BAC 中,表明这2 个EST 片段分别属于2 个不同的基因, 然后把这2 个基因分别命名为B T2A 和B T2B 。因此,在基因的两端设计引物有可能直接克隆这2 个基因,来确认这些基因是否存在。
2. 2 　B T2A 和B T2B 全长cDNA 的获得及蛋白结构分析
PCR 的扩增结果见图1A。目标扩增片段长度在1. 2 kb 左右,由于扩增结果是单一的带,而且大小符合,就认为是目标片段。然后回收目标片段,做克隆后测序。用测序得到的序列在GenBank 中Blast x ,结果表明,测序结果正确为目标基因序列。并把基因序列在GenBank 中注册,B T2A 和B T2B的注册号码分别为EU590667 , EU590668 。分析表明,这2 个基因都包含有一个完整的1 221 bp 长的开放阅读框,这2 个基因都编码一个由含406 个氨基酸组成的分子量为43 647Da 的蛋白。

　　B T2A 和B T2B 蛋白分别在氮端含一个59 ,58个氨基酸残基组成的叶绿体信号肽,紧随其后的是一个分别为75 ,76 个氨基酸长的可变区,碳端则都是286 个氨基酸长的该蛋白的功能域(图2) 。虽然信号肽的长度不同,但是信号肽剪切位点两侧氨基酸是相同的(图2) 。同其他ADP - 葡萄糖转运蛋白一样,B T2A 在C - 端功能域具有3 个连续的线粒体能量转运区[7 ] ,长度分别是81 ,82 ,66 个氨基酸;B T2B 也同样具有3 个长度也相同的连续的线粒体跨膜转运区 。聚类分析也表明,B T 基因可以分为3 类, B T2A 和B T2B 首先与水稻B T 基因聚在一起。由此可以判断,克隆到的基因应是在植物中普遍存在的B T 类基因:B T2A 及B T2B 。
2. 3 　B T2A 和B T2B 在B T 家族中的地位
对在GenBank 数据库中获得B Ts 的序列进行聚类分析,研究了B T2A 及B T2B 与其他B T 蛋白的关系及其在进化中的地位,根据氨基酸序列相似性特征可以分为2 类: ( Ⅰ) 双子叶B T 蛋白家族;( Ⅱ) 单子叶B T 蛋白家族,该家族又可以分为2 个亚家族(图3) 。B T2A 与B T2B 属于单子叶B T 族,并优先和水稻的B T2 聚在一起。由于该基因在水稻上是一个而在玉米是2 个,可以得出B T2A 和B T2B 是在水稻和玉米分化后,在玉米进化中由基因倍增产生的。B T2A 在植株的胚乳、叶片和根中都可以检测到表达;而B T2B 在胚乳发育的中晚期表达( 图1B) 。表明这2个基因已经具有了亚功能的分化。综合这些结果, 玉米中的确存在2 个B T2 基因即B T2A 和B T2B 。

3 　讨论
水稻基因组测序完成后,为其他禾谷类作物同源基因的克隆和研究提供了很大方便。我们就是在用水稻的相应基因序列搜索数据库获得玉米B T2A基因和B T2B 基因的EST 序列和基因组序列,从而为直接用普通PCR 方法克隆了该基因打下了基础。这种不通过RACE 来克隆基因的方法可以节省大量人力和财力。B T2A 基因在叶片中表达,但是目前还没有发现叶片中ADP - 葡萄糖也在细胞质中合成的证据。体外试验证明,B T1 蛋白也具有负责AMP 与ADP 交换功能。B T1 蛋白具有被认为是必需的ADP - 葡萄糖结合基序(motif) KXGGL ,而在这2 个蛋白中与之相对应的氨基酸序列是GV GGL 。从这个角度分析,这2 个基因是否确实具有转运ADP - 葡萄糖功能尚需要进一步鉴定。在禾本科植物分离后大约1 200 万年前,玉米基因组发生了一次倍增,在倍增之后,随着着丝粒的融合,大量染色体片段的丢失,又重新二倍化,在这个过程中有部分倍增后的基因保留下来了 。从聚类分析来看,B T2A 和B T2B 应是玉米基因组单独倍增的产物。Force[9 ] 提出倍增后的基因由于基因功能的歧化保留下来而不是被淘汰。从B T2A 和B T2B 的组织时空特异性表达歧化来看符合这一理论。总之,玉米中的确存在2 个B T2 基因即B T2A和B T2B 。